Vi undersøkte om DNA fra yngelråtebakterier kan påvises i voks etter autoklavering, og hva det kan bety for overvåkingen av disse sykdommene i Norge. Artikkelforfattere: Krzysztof Rutkowski, Henning Sørum, Bjørn Dahle & Lucy Robertson.
Bakgrunn
Lukket- og åpen yngelråte er bakterieinfeksjoner som rammer larvene til honningbia (Apis mellifera). Lukket yngelråte skyldes bakterien Paenibacillus larvae, mens åpen yngelråte skyldes bakterien Melissococcus plutonius. Begge sykdommene er listeførte i Norge, og Mattilsynet har ansvar for diagnostikk og bekjempelse av sykdommene.
Forekomsten av begge sykdommer i Norge har historisk vært lav, og utbrudd har vært sporadiske og lokale. Norges topografi, lave tetthet av bifolk og geografiske avstand mellom mange bigårder begrenser trolig smittespredning. I flere andre deler av Europa og verden er sykdommene mer utbredt.
Antibiotika er ikke tillatt i birøkt i Norge eller EU. Sykdomskontrollen i Norge bygger derfor på overvåking og tiltak som karantene, flytteforbud og destruksjon av smittede bifolk, inkludert bifolk som er påvist smittet uten å ha symptomer. Det stiller store krav til at diagnostiske metoder er pålitelige.
Problemstilling
Bivoks er et verdifullt materiale i birøkt og blir i stor grad resirkulert. Gamle vokskaker smeltes til blokker, og blokkene brukes til å lage nye byggevoksplater. Siden smitte kan overføres med bier og kontaminert utstyr, blir voksen varmebehandlet før den presses til byggevoks. I Norge skjer det vanligvis ved at flytende voks holdes på 120–121 °C under trykk i omtrent 30 minutter. Behandlingen, som kalles autoklavering, gjør bakteriene ikke-smittsomme. Det gjelder også P. larvae, som kan danne svært motstandsdyktige sporer.
Det er mindre klart hva behandlingen gjør med bakterienes DNA. Dette har praktisk betydning, fordi det nasjonale overvåkingsprogrammet for åpen og lukket yngelråte bygger på analyse av voksnedfall fra kubene med qPCR som kan påvise DNA fra yngelråtebakterier. Målet med undersøkelsen var å finne ut om voks fra tavler fra smittede bigårder, selv etter at voksen har gjennomgått autoklavering, kan inneholde påvisbare DNA-rester.
Metoder
Vi samlet inn 20 yngeltavleprøver fra like mange bifolk i Sverige og Estland. Prøvene omfattet tavler fra bifolk med klinisk åpen yngelråte og tavler fra bifolk hvor man mistenkte lukket yngelråte. Fra hver prøve ble voksdekslene over cellene skavet av. Dette materialet ligner det som samler seg som voksnedfall i en kube. I tillegg inkluderte vi positive kontroller med bivoks tilsatt dyrkede M. plutonius og P. larvae.
Behandlingen av den avskrapte voksen skulle etterligne industriell voksbehandling og ble tilpasset i samråd med et norsk voksfirma. Prøvene ble først varmet til 80 °C i vannbad i 10 minutter, som tilsvarer at birøktere smelter ned gamle tavler. Deretter ble de autoklavert ved 121 °C i 30 minutter og til slutt holdt ved 70 °C i åtte timer, noe som etterligner den fasen i industrien der voks og vann skilles. Voksen ble blandet med vann i forholdet 1 til 20 (se bildet).
Prøvene ble analysert med qPCR før og etter behandling. qPCR er en metode som kopierer opp bestemte DNA-biter og måler hvor mange av dem som finnes i en prøve. Metoden er svært følsom og egner seg til å finne små mengder bakterier, blant annet i bifolk som er smittet uten å ha synlige symptomer. Samtidig kan metoden ikke skille mellom DNA fra levende og døde bakterier.
Resultatet oppgis som en Cq-verdi (også kalt Ct verdi). DNA-mengden i prøven omtrent dobles for hver kopieringsrunde, og Cq-verdien angir hvor mange runder som trengs før signalet kan måles. Lav Cq betyr mye DNA, høy Cq betyr lite DNA i prøven i utgangspunktet. I denne studien ble prøver med Cq over 40 regnet som negative. En økning i Cq på 10 tilsvarer omtrent tusen ganger mindre DNA som kan kopieres. Vi brukte de samme testene som i det nasjonale overvåkingsprogrammet, slik at resultatene er direkte relevante for gjeldende diagnostikk. Bienes eget DNA ble i tillegg målt som kontroll på prøvekvalitet.
Resultater
Før behandling. I voksprøvene ble M. plutonius påvist i 12 av 20 prøver og P. larvae i 11. 7 prøver, alle fra Sverige, var positive for begge.
| Materiale | Mål | Før behandling | Etter behandling |
| Voksprøver (n = 20) | P. larvae | 11 positive | 0 positive |
| Voksprøver (n = 20) | M. plutonius | 12 positive | 5 positive |
Oversikt over antall positive prøver før og etter behandling. Tallene er hentet fra studiens tabeller.
Etter behandling
Lukket yngelråte (P. larvae). Etter autoklavering var DNA fra P. larvae ikke lenger påvisbart i noen av de 11 prøvene som var positive i utgangspunktet.
Åpen yngelråte (M. plutonius). DNA fra M. plutonius var fortsatt påvisbart i 5 av de 12 prøvene som var positive før behandling. Signalet var betydelig svekket, med økning i Cq-verdi fra omtrent 9 til nesten 25 runder, men Cq-verdiene etter behandling lå mellom 23,40 og 38,91. Variasjonen mellom prøvene var stor. Flere av prøvene med høyest utgangsnivå ble negative, mens andre beholdt signalet.
Bienes eget DNA. Dette var påvisbart i alle prøver etter behandling, men mengden var redusert med i gjennomsnitt omtrent 17,5 Cq-enheter. Det tilsvarer at mer enn 99,999 prosent av det kopierbare DNA-et var borte.
Figur: qPCR Cq verdier før og etter autoklavering av voks fra yngeltavler (n = 20) for henholdsvis honningbie (Apis mellifera), Melissococcus plutonius (åpen yngelråte) og Paenibacillus larvae (AFB). Røde symboler og linjer angir prøver hvor DNA ikke er påvisbart etter autoklavering, mens blå symboler og linjer angir prøver hvor DNA er påvisbart etter autoklavering.
Mulige forklaringer
Hva kan forklare forskjellene mellom de to bakteriene?
- Utvasking med vann. DNA løser seg i vann, mens voks er et fettstoff. Det er derfor sannsynlig at en stor del av DNA-et ble vasket ut av voksen under autoklaveringen og endte i vannfasen. DNA som likevel ble påvist, kan ha sittet i en tynn vannfilm på overflaten av voksen eller i organisk materiale som fulgte med, siden voksen var fuktig da den ble tatt ut.
- Størrelsen på DNA-biten. Den diagnostiske metoden som til nå har vært brukt i OK programmet og for påvisning av P. larvae ved kliniske symptomer leter etter en DNA-bit på 378 basepar, mens testen for M. plutonius leter etter en kortere bit på 69 basepar. Lengre biter har høyere sannsynlighet for å bli knekt av varme og trykk. Det kan bidra til å forklare hvorfor P. larvae forsvant fra voksprøvene. Det er verdt å merke seg at en qPCR som leter etter kortere DNA sekvenser for påvisning av P. larvae kanskje kan påvise P. larvae i den autoklaverte voksen. Genregionen som velges i en PCR må være passe konservert: alle individer av en art må være like, men individer av en andre arter må være annerledes.
- Forskjeller mellom bakteriene. P. larvae danner sporer, og i smittede larver kan det være svært mange av dem. Mens autoklavering i 30 minutter er nok til å ødelegge dem er de kjent for å være svært motstandsdyktige mot varme. M. plutonius danner ikke sporer og det er mulig at DNA fra sporer og fra vanlige celler kan ha oppført seg ulikt.
Forvaltningskonsekvenser og anbefalinger
Resultatene fra undersøkelsen viser at standard autoklavering av voks fra bifolk med klinisk åpen yngelråte ikke alltid fjerner DNA fra M. plutonius fullstendig. Byggevoks laget av slik voks kan derfor i teorien inneholde DNA-rester som en følsom qPCR-test kan påvise, også når det ikke finnes levende bakterier.
Det er likevel flere grunner til at det er lite sannsynlig at dette gir utslag i praksis:
- Fortynning. Voksfabrikker blander typisk store mengder voks, ofte fra flere bigårder. Voks fra ett smittet bifolk vil bli fortynnet. Sammen med utvaskingen under autoklaveringen kan dette gi DNA-nivåer under deteksjonsgrensen i ferdig byggevoks.
- Nybygd voks. Biene dekker byggevoksen med nysekretert voks i løpet av noen uker. Voksnedfallet består hovedsakelig av avbitte celledeksler, avføring og annet avfall og inneholder trolig lite voks fra selve byggevoksen.
- Håndtering av syke bifolk. Hvis bifolk med klinisk sykdom saneres og vokskakene destrueres, havner ikke voks fra disse hos voksprodusentene.
For områder med lav forekomst av yngelråtesykdommer, slik som Norge, vurderer vi qPCR som et trygt og pålitelig verktøy for å finne bifolk som bærer bakterier uten symptomer, med lav risiko for falske positive resultater på grunn av DNA fra byggevoks. Dette forutsetter at bifolk der DNA fra yngelråtebakterier påvises, konsekvent saneres, slik at mengden DNA i voksen holdes lav. I et OK program bør det likevel ikke være rutine at et positivt prøvesvar automatisk gir saneringsvedtak. En påvisning i et OK program er ikke basert på klinisk sykdom og man har da tid til å ta ytterligere prøver for å lokalisere smitte i større driftsenheter og undersøke driftsenheten for kliniske symptom for den påviste bakterien.
Siden vi likevel ikke kan utelukke at små voksbiter faller ned på bunnbrettet og gir positive prøver, bør det undersøkes om dette skjer i praksis ved å gjennomføre forsøk hvor byggevoks med målbare nivå av P. larvae/M. plutonius tilsettes i smittefrie bifolk og deretter analysere voksnedfall fra bifolkene.
Kilde
Rutkowski K., Sørum H., Dahle B. & Robertson L. 2026. Detectability of Melissococcus plutonius and Paenibacillus larvae DNA in Beeswax Following Thermal Processing. Journal of Invertebrate Pathology, 10.1016/j.jip.2026.108782
